Δυστροφίας Ωχράς Κηλίδας, Πλήρης Γονιδιακός Έλεγχος

Ο Πλήρης Γονιδιακός Έλεγχος για τη Δυστροφίας Ωχράς Κηλίδας χρησιμοποιεί τεχνολογία αλληλούχισης νέας γενιάς (NGS) για την ανάλυση 28 γονιδίων που σχετίζονται με κληρονομικές δυστροφίες ωχράς και αμφιβληστροειδούς.Πρόκειται για στοχευμένο πάνελ γονιδίων, σχεδιασμένο ώστε να υποστηρίζει την ακριβή διάγνωση, την εκτίμηση του κινδύνου και την πρόληψη.

Περισσότερες Πληροφορίες

Ο Πλήρης Γονιδιακός Έλεγχος για τη Δυστροφίας Ωχράς Κηλίδας αποτελεί ένα ολοκληρωμένο γενετικό τεστ που έχει σχεδιαστεί για την αξιολόγηση ατόμων με κλινική υποψία ή επιβεβαιωμένη διάγνωση κληρονομικών δυστροφιών της ωχράς κηλίδας. Περιλαμβάνει την ανάλυση ενός συνόλου γονιδίων, ενσωματώνοντας τόσο κωδικοποιητικές όσο και επιλεγμένες μη κωδικοποιητικές παραλλαγές, παρέχοντας εκτενή εκτίμηση της γενετικής βάσης της νόσου. Ο πλήρης γονιδιακός έλεγχος για τη δυστροφίας ωχράς κηλίδας είναι ιδιαίτερα κατάλληλος για περιπτώσεις πρώιμης έναρξης ή οικογενούς εκφύλισης της ωχράς και εντάσσεται επίσης σε ευρύτερες στρατηγικές ελέγχου δυστροφιών του αμφιβληστροειδούς. Δεν προορίζεται για τη διερεύνηση μεμονωμένης ηλικιακής εκφύλισης της ωχράς κηλίδας. Ο πλήρης γονιδιακός έλεγχος για τη δυστροφίας ωχράς κηλίδας χρησιμοποιείται για την υποστήριξη της διαφορικής διάγνωσης, τη διευκρίνιση της αιτιολογίας της νόσου και την ακριβέστερη ταξινόμηση των σχετικών δυστροφιών.

Ο πλήρης γονιδιακός έλεγχος για τη δυστροφίας ωχράς κηλίδας περιλαμβάνει γονίδια που διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη δομή του αμφιβληστροειδούς, τη διατήρηση των φωτοϋποδοχέων και τη λειτουργία του οπτικού κύκλου. Ενδεικτικά, γονίδια όπως τα BEST1, PRPH2, ABCA4 και ELOVL4 εμπλέκονται σε διεργασίες όπως η μεταφορά ιόντων μέσω του μελαγχρόου επιθηλίου του αμφιβληστροειδούς, η ακεραιότητα των εξωτερικών τμημάτων των φωτοϋποδοχέων και ο μεταβολισμός λιπιδίων που είναι κρίσιμος για τη διατήρηση της ομοιόστασης του αμφιβληστροειδούς. Οι βιολογικές αυτές οδοί είναι απαραίτητες για τη διατήρηση της κεντρικής όρασης και της λειτουργίας της ωχράς κηλίδας. Η διαταραχή τους οδηγεί σε προοδευτική εκφύλιση του αμφιβληστροειδούς και απώλεια όρασης. Ο πλήρης γονιδιακός έλεγχος για τη δυστροφίας ωχράς κηλίδας ενδείκνυται σε άτομα που παρουσιάζουν κλινικά χαρακτηριστικά ενδεικτικά κληρονομικής δυστροφίας της ωχράς ή ανεξήγητη απώλεια κεντρικής όρασης.

Οι δυστροφίες της ωχράς κηλίδας αποτελούν μία κλινικά ετερογενή ομάδα σπάνιων οφθαλμολογικών διαταραχών που επηρεάζουν την ωχρά, την κεντρική περιοχή του αμφιβληστροειδούς που είναι υπεύθυνη για την υψηλής ευκρίνειας όραση. Τα συμπτώματα περιλαμβάνουν συνήθως προοδευτική απώλεια της κεντρικής όρασης, μείωση της οπτικής οξύτητας και παραμόρφωση της όρασης (μεταμορφοψία), ενώ η περιφερική όραση και η προσαρμογή στο σκοτάδι συχνά διατηρούνται. Η δυστροφία της ωχράς τύπου Best χαρακτηρίζεται από αμφοτερόπλευρη κιτρινωπή βλάβη τύπου «κρόκου αυγού» και συνήθως εμφανίζεται στην παιδική ηλικία με αργή εξέλιξη. Η ενήλικη μορφή (λεκιθόμορφη εκφύλιση ή vitelliform) εμφανίζεται αργότερα στη ζωή με ηπιότερα αλλά μεταβλητά χαρακτηριστικά. Η νόσος Stargardt αποτελεί τη συχνότερη νεανική μορφή, με σημαντική γενετική και φαινοτυπική ετερογένεια και προοδευτική εκφύλιση του αμφιβληστροειδούς με χαρακτηριστικά ευρήματα στο βυθό. Η κλινική εικόνα μπορεί να ποικίλλει σημαντικά ακόμη και μεταξύ μελών της ίδιας οικογένειας.

Ο πλήρης γονιδιακός έλεγχος για τη δυστροφίας ωχράς κηλίδας προσφέρει σημαντική κλινική αξία, καθώς επιτρέπει την ταυτοποίηση παθογόνων παραλλαγών που σχετίζονται με κληρονομικές δυστροφίες της ωχράς. Συμβάλλει στην ακριβή μοριακή διάγνωση, διευκολύνει τη διάκριση μεταξύ επικαλυπτόμενων παθήσεων του αμφιβληστροειδούς και ενισχύει την ορθή ταξινόμηση της νόσου. Τα αποτελέσματα μπορούν να συμβάλουν στην κατανόηση της εξέλιξης της νόσου, στην εκτίμηση της πρόγνωσης και στην υποστήριξη κατάλληλων στρατηγικών παρακολούθησης ή μελλοντικών θεραπευτικών προσεγγίσεων. Επιπλέον, ενισχύεται η εκτίμηση του οικογενειακού κινδύνου και η κατανόηση των συσχετίσεων γονότυπου–φαινότυπου στις παθήσεις της ωχράς.

Αυξημένος γενετικός κίνδυνος επιβεβαιώνεται όταν ανιχνεύονται παθογόνες μεταλλάξεις σε γονίδια που σχετίζονται με δυστροφίες της ωχράς κηλίδας. Μειωμένος κίνδυνος μπορεί να συναχθεί όταν δεν ανιχνεύονται μεταλλάξεις, αν και η συστηματική κλινική παρακολούθηση παραμένει απαραίτητη. Η ενσωμάτωση των γενετικών δεδομένων με τα κλινικά ευρήματα και τα απεικονιστικά δεδομένα είναι κρίσιμη για την ακριβή διάγνωση, την πρόγνωση και τη μακροχρόνια διαχείριση των ασθενών.

Η εξέταση διενεργείται σε κλινικό εργαστήριο διαπιστευμένο κατά ISO 15189 και πιστοποιημένο από CLIA και CAP, εξασφαλίζοντας την εγκυρότητα, την ακρίβεια και τη διεθνή αναγνώριση των αποτελεσμάτων.

Γονίδια και Συσχετιζόμενοι Φαινότυποι (Πλήρης Γονιδιακός Έλεγχος για Δυστροφία Ωχράς Κηλίδας)

Ο γενετικός έλεγχος του γονιδίου πραγματοποιείται με τη λήψη ενός δείγματος αίματος ή με τη λήψη γενετικού υλικού από το εσωτερικό των παρειών (με μπατονέτα) και μπορεί να γίνει:

• Με λήψη του δείγματος στη Διαγνωστική Αθηνών. Κλείστε το ραντεβού σας σε πραγματικό χρόνο και αγοράστε την εξέταση online
• Με λήψη του δείγματος στο σπίτι. Σας στέλνουμε όλα τα απαραίτητα υλικά συλλογής στο σπίτι σας μέσω courier. Η επιστροφή του δείγματος στο εργαστήριο γίνεται επίσης μέσω courier. Αγοράστε την εξέταση online

Πλεονεκτήματα της Εξέτασης

Η εξέταση χαρακτηρίζεται από τα ακόλουθα πλεονεκτήματα:

• Η πλειονότητα των περιστατικών φυλοσύνδετης μελαγχρωστικής αμφιβληστροειδίτιδας (X-linked retinitis pigmentosa ή RP) οφείλεται σε μεταλλάξεις του γονιδίου RPGR. Σημαντικό ποσοστό αυτών εντοπίζεται σε μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδίου, το εξώνιο ORF15 (567 αμινοξέων), το οποίο έχει την ιδιαιτερότητα ότι αποτελεί «hotspot» μεταλλάξεων και ευθύνεται για περίπου τα δύο τρίτα των παθογόνων παραλλαγών. Η περιοχή ORF15 χαρακτηρίζεται από επαναλαμβανόμενη, πλούσια σε πουρίνες αλληλουχία, η οποία συνήθως παρουσιάζει μειωμένη απόδοση σε αναλύσεις με τεχνολογία NGS. Το παρόν τεστ βασίζεται σε εξειδικευμένη μέθοδο που επιτυγχάνει πλήρη κάλυψη (>20x) με υψηλή ποιότητα χαρτογράφησης (mapping quality >20) στο 100% των περιοχών-στόχων του γονιδίου RPGR. Η επικύρωση της μεθόδου έδειξε υψηλό μέσο βάθος κάλυψης (139x) για το συγκεκριμένο γονίδιο. Συνεπώς, το παρόν NGS πάνελ δεν αναμένεται να παρουσιάζει σημαντικούς περιορισμούς στην ανίχνευση παραλλαγών στο γονίδιο RPGR, συμπεριλαμβανομένου του εξονίου ORF15.
• Η ανάλυση πραγματοποιείται σε διαπιστευμένο εργαστήριο (CAP) με τη συμμετοχή πιστοποιημένου προσωπικού (CLIA) σε κλινικές εξετάσεις.
• Χρησιμοποιούνται προηγμένες τεχνολογίες αλληλούχησης, μέθοδοι εμπλουτισμού στόχου υψηλής απόδοσης και ακριβείς βιοπληροφορικές διαδικασίες, οι οποίες εξασφαλίζουν κορυφαία αναλυτική επίδοση.
• Τα περιεχόμενα των γονιδιακών πάνελ έχουν κατασκευαστεί με προσοχή ώστε να είναι κλινικά αποτελεσματικά και επιστημονικά τεκμηριωμένα.
• Σε ορισμένα γονιδιακά πανελ περιλαμβάνεται η ολική αλληλούχηση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος (βλ. ενότητα Γονίδια που Ελέγχονται).
• Στην κλινικού επιπέδου NGS ανάλυση περιλαμβάνονται περίπου 2.000 μη κωδικοποιητικές παθογόνες παραλλαγές (βλ. ενότητα Μη κωδικοποιητικές παραλλαγές που καλύπτονται από τον πίνακα).
• Εφαρμόζεται αυστηρό σύστημα ταξινόμησης παραλλαγών.
• Χρησιμοποιείται συστηματική ροή ερμηνείας με ιδιόκτητο λογισμικό, που επιτρέπει ακριβή και ιχνηλάσιμη επεξεργασία των δεδομένων NGS.
• Παρέχονται αναλυτικές και ολοκληρωμένες κλινικές αναφορές.

Περιορισμοί της Εξέτασης

Υπάρχουν ορισμένοι τεχνικοί και βιολογικοί περιορισμοί:

• Τα ακόλουθα εξόνια δεν περιλαμβάνονται στο πάνελ, καθώς δεν καλύπτονται επαρκώς από υψηλής ποιότητας αναγνώσεις αλληλούχισης: *NMNAT1* (NM_001297779:5).
• Γονίδια με υποβέλτιστη κάλυψη σημειώνονται με δίεση (#), ενώ εκείνα με τμηματικούς διπλασιασμούς (μερικούς ή ολικούς) που επικαλύπτονται με περιοχές ψευδογονιδίων κατά UCSC σημειώνονται με αστερίσκο (*).
• Ένα γονίδιο θεωρείται ότι έχει υποβέλτιστη κάλυψη όταν >90% των στοχευμένων νουκλεοτιδίων δεν καλύπτονται σε >20x με δείκτη ποιότητας χαρτογράφησης (MQ>20). Στις περιπτώσεις αυτές, η ανίχνευση παραλλαγών μπορεί να είναι περιορισμένη.

Δεν ανιχνεύονται μέσω της εξέτασης:

• Πολύπλοκες αναστροφές
• Μετατροπές γονιδίων (gene conversions)
• Ισορροπημένες μεταθέσεις
• Διαταραχές επαναλήψεων (repeat expansion disorders), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά
• Μη κωδικοποιητικές παραλλαγές πέραν των ±20 ζευγών βάσεων από τα όρια εξονίων–ιντρονίων, εκτός αν έχει καθοριστεί διαφορετικά
• Ολόκληρο το μιτοχονδριακό γονιδίωμα δεν περιλαμβάνεται σε όλα τα γονιδιακά πάνελ (βλ. Γονίδια που Ελέγχονται)

Η ανίχνευση ενδέχεται να μην είναι αξιόπιστη για:

• Χαμηλού επιπέδου μωσαϊκισμό σε πυρηνικά γονίδια (παραλλαγές με συχνότητα ελάσσονος αλληλίου ~14,6% ανιχνεύονται με πιθανότητα 90%)
• Εκτεταμένες ακολουθίες μονονουκλεοτιδικών επαναλήψεων
• Χαμηλού επιπέδου ετεροπλασμία σε mtDNA (ανιχνεύεται >90% σε επίπεδο 5%)
• Ενθέσεις/απαλοιφές >50 ζευγών βάσεων
• Διαγραφές ή διπλασιασμούς ενός εξονίου
• Παραλλαγές σε περιοχές ψευδογονιδίων ή διπλασιασμένα τμήματα του γονιδιώματος
• Παθογόνες παραλλαγές του mtDNA που δεν ανιχνεύονται στο αίμα· σε αυτές τις περιπτώσεις ενδέχεται να απαιτείται δείγμα από μετα-μιτωτικό ιστό (π.χ. σκελετικός μυς) για την επιβεβαίωση της διάγνωσης

Για πρόσθετες λεπτομέρειες, δείτε την ενότητα Βιοπληροφορική & Απόδοση.

Βιοπληροφορική

Η στοχευμένη περιοχή για κάθε γονίδιο περιλαμβάνει τα κωδικά εξόνια καθώς και ±20 ζεύγη βάσεων από τα όρια εξονίου–ιντρονίου. Επιπλέον, το πάνελ μπορεί να περιλαμβάνει μη κωδικές και ρυθμιστικές παραλλαγές, όπως αναφέρεται στην ενότητα «Μη κωδικές παραλλαγές που καλύπτονται από το πάνελ». Συγκεκριμένες περιοχές ορισμένων γονιδίων ενδέχεται να εξαιρεθούν από την ανάλυση, εφόσον αυτό αναφέρεται στην ενότητα «Περιορισμοί της εξέτασης». Όταν η εξέταση περιλαμβάνει το μιτοχονδριακό γονιδίωμα, η στοχευμένη περιοχή καλύπτει επίσης το σύνολο των μιτοχονδριακών γονιδίων.

Τα δεδομένα αλληλούχισης επεξεργάζονται μέσω ιδιόκτητου συστήματος ανάλυσης και σχολιασμού του συνεργαζόμενου διαπιστευμένου εργαστηρίου, το οποίο ενσωματώνει προηγμένους αλγορίθμους και λογισμικά. Στην πορεία της διαδικασίας έχουν ενσωματωθεί πολλαπλά στάδια ποιοτικού ελέγχου, διασφαλίζοντας την ακρίβεια, την εγκυρότητα και τη συνέπεια των αποτελεσμάτων. Η ανάλυση έχει βελτιστοποιηθεί ώστε να μεγιστοποιεί την ευαισθησία χωρίς να θυσιάζει την ειδικότητα.

Όλα τα ευρήματα συνοψίζονται σε λεπτομερή κλινική αναφορά, η οποία περιλαμβάνει δείκτες ποιότητας αλληλούχισης, πληροφορίες κάλυψης σε επίπεδο γονιδίου και επισήμανση πιθανών περιοχών με χαμηλότερη κάλυψη (<20x για τα πυρηνικά γονίδια και <1000x για το μιτοχονδριακό DNA, όπου εφαρμόζεται). Με αυτόν τον τρόπο διασφαλίζεται η διαφάνεια και υποστηρίζεται η ακριβής κλινική ερμηνεία.

Απόδοση Ανάλυσης

Τα γονίδια που περιλαμβάνονται στο πάνελ έχουν επιλεγεί προσεκτικά, με βάση επιστημονική βιβλιογραφία, βάσεις δεδομένων μεταλλάξεων και τη συσσωρευμένη κλινική εμπειρία.

Όλα τα πάνελ προέρχονται από κλινικού επιπέδου, υψηλής ποιότητας ανάλυση NGS. Αναλυτικές πληροφορίες σχετικά με την ικανότητα ανίχνευσης διαφορετικών τύπων γενετικών αλλοιώσεων παρουσιάζονται στον πίνακα απόδοσης ανάλυσης και ανίχνευσης (βλ. Πίνακα).

Η εξέταση έχει επικυρωθεί για διάφορους τύπους δειγμάτων, όπως αίμα σε EDTA, απομονωμένο DNA (εκτός DNA από ιστούς ενσωματωμένους σε παραφίνη με φορμόλη), σάλιο και αποξηραμένες σταγόνες αίματος σε κάρτες. Οι συγκεκριμένοι τύποι δειγμάτων επιλέχθηκαν ώστε να εξασφαλίζεται η μέγιστη πιθανότητα λήψης DNA υψηλής ποιότητας. Η διαγνωστική απόδοση μπορεί να διαφέρει ανάλογα με τον τύπο της εξέτασης, τον θεράποντα ιατρό, το νοσοκομείο και τη χώρα. Η ανάλυση Plus που χρησιμοποιείται ενισχύει περαιτέρω την πιθανότητα γενετικής διάγνωσης, καθώς οι μεγάλες απαλοιφές και διπλασιασμοί δεν μπορούν να ανιχνευθούν αποκλειστικά μέσω αλληλούχισης. Η προσέγγιση αυτή συνδυάζει τόσο την αλληλούχιση όσο και την ανάλυση απαλοιφών/διπλασιασμών (copy number variants, CNVs).

Οι δείκτες απόδοσης που παρατίθενται παρακάτω βασίζονται σε αρχική επικύρωση που πραγματοποιήθηκε σε διαπιστευμένο κλινικό εργαστήριο, με ισοδύναμα αποτελέσματα να έχουν επιβεβαιωθεί και σε επιπλέον εργαστηριακές εγκαταστάσεις.

Απόδοση της κλινικής βαθμίδας NGS ανάλυσης, για τα πάνελ γονιδιακών ελέγχων

Δείκτες κάλυψης

Απόδοση ανάλυσης μιτοχονδριακού γονιδιώματος

Δείκτες κάλυψης μιτοχονδριακής ανάλυσης

Παρέχονται ολοκληρωμένες κλινικές αναφορές, σχεδιασμένες ώστε να προσφέρουν στους θεράποντες ιατρούς ουσιαστικές και αξιοποιήσιμες πληροφορίες. Η κλινική ερμηνεία απαιτεί στέρεη γνώση της κλινικής γενετικής και των γενετικών αρχών. Οι αναφορές συντάσσονται από ομάδες μοριακών γενετιστών, ειδικών ιατρών και άλλων έμπειρων επαγγελματιών, οι οποίοι αξιολογούν τις ταυτοποιημένες γενετικές παραλλαγές σε συνάρτηση με τα φαινοτυπικά δεδομένα που παρέχονται στο ιατρικό ιστορικό.

Στόχος είναι οι αναφορές να είναι κλινικά χρήσιμες και κατανοητές από όλους τους επαγγελματίες υγείας, ανεξάρτητα από το επίπεδο εκπαίδευσής τους στη γενετική. Κεντρικό ρόλο κατέχει η ταξινόμηση των παραλλαγών, η οποία καθορίζει την ερμηνεία και κατευθύνει τις αποφάσεις για τη διαχείριση των ασθενών. Η ταξινόμηση πραγματοποιείται σύμφωνα με τις κατευθυντήριες οδηγίες ACMG 2015. Παραλλαγές αλληλουχίας και αριθμού αντιγράφων που ταξινομούνται ως παθογόνες, πιθανώς παθογόνες ή αμφίβολης σημασίας (VUS), επιβεβαιώνονται με διπλής κατεύθυνσης αλληλούχηση Sanger ή με μεθόδους όπως qPCR/ddPCR, όταν οι ποιοτικοί δείκτες του NGS δεν επαρκούν για ένα αποτέλεσμα υψηλής αξιοπιστίας.

Σε κάθε αναφορά περιλαμβάνονται πίνακες με τις παραλλαγές στην αλληλουχία και στον αριθμό αντιγράφων, στους οποίους παρουσιάζονται βασικές πληροφορίες όπως γονιδιωματικές συντεταγμένες, ονοματολογία HGVS, ζυγωτία, συχνότητες αλληλίων, προβλέψεις in silico, φαινοτυπικές συσχετίσεις και η ταξινόμηση της παραλλαγής. Επιπλέον, παρέχονται αναλυτικές περιγραφές για την παραλλαγή, το γονίδιο και τους σχετικούς φαινότυπους, περιλαμβάνοντας τον ρόλο του γονιδίου στη νόσο, το φάσμα μεταλλάξεων, δεδομένα πληθυσμιακής συχνότητας και συσχετίσεις με παθολογικές καταστάσεις. Παρατίθενται επίσης βιβλιογραφικές αναφορές, περιλήψεις και βάσεις δεδομένων, ώστε να είναι δυνατή η περαιτέρω αξιολόγηση των ευρημάτων.

Οι αναφορές διαρθρώνονται σε δύο ενότητες: κύρια ευρήματα και πρόσθετα ευρήματα.

Κύρια ευρήματα θεωρούνται οι παραλλαγές που είναι γνωστό ότι προκαλούν νόσο ή οι σπάνιες παραλλαγές που μπορούν να εξηγήσουν τον φαινότυπο του ασθενούς. Στο συμπέρασμα συνοψίζονται όλα τα διαθέσιμα δεδομένα και παρατίθεται η τεκμηρίωση της ταξινόμησης.

Πρόσθετα ευρήματα περιλαμβάνουν παραλλαγές που, σύμφωνα με τα τρέχοντα δεδομένα, δεν επαρκούν για να εξηγήσουν τον φαινότυπο. Σε αυτά περιλαμβάνονται ετερόζυγες παραλλαγές σε γονίδια με αυτοσωμικό υπολειπόμενο πρότυπο, παραλλαγές αμφίβολης σημασίας σε αυτοσωμικά επικρατή γονίδια (όταν υπάρχει ήδη παθογόνος ή πιθανώς παθογόνος παραλλαγή που ερμηνεύει τον φαινότυπο), καθώς και αλληλόμορφα κινδύνου που ανιχνεύονται στα εξεταζόμενα γονίδια.

Η ανίχνευση παθογόνων ή πιθανώς παθογόνων παραλλαγών σε επικρατή νοσήματα ή ο συνδυασμός παραλλαγών σε αμφότερα τα αλληλόμορφα σε υπολειπόμενα νοσήματα θεωρείται μοριακή επιβεβαίωση της κλινικής διάγνωσης. Σε αυτές τις περιπτώσεις, ο έλεγχος συγγενών μπορεί να αξιοποιηθεί για εκτίμηση του κινδύνου. Δεν συνιστάται η χρήση των παραλλαγών αμφίβολης σημασίας (VUS) για οικογενειακή εκτίμηση του κινδύνου ή για λήψη κλινικών αποφάσεων. Η γενετική συμβουλευτική κρίνεται απαραίτητη.

Αναλύονται εκατομμύρια παραλλαγές από χιλιάδες περιστατικά σπάνιων νοσημάτων, με αποτέλεσμα να εμπλουτίζεται συνεχώς η βάση δεδομένων και η κατανόηση των σχέσεων παραλλαγών–φαινοτύπου. Με την πάροδο του χρόνου, παραλλαγές που είχαν αναφερθεί σε παλαιότερες αναφορές ενδέχεται να αναταξινομηθούν. Εάν κάποια παραλλαγή που είχε δηλωθεί ως κύριο ή πρόσθετο εύρημα αλλάξει κατηγορία (π.χ. από VUS σε παθογόνο/πιθανώς παθογόνο ή αντίστροφα) εκδίδεται επικαιροποιημένη αναφορά προς τον θεράποντα ιατρό χωρίς πρόσθετη οικονομική επιβάρυνση.